RESUMO

OBJETIVO: Conhecer os efeitos do diabetes e o impacto de seu tratamento medicamentoso em curto e longo prazo sobre os vasos da coróide e membrana de Bruch. MÉTODOS: Foram estudados 30 ratos Wistar, divididos em 3 grupos experimentais: grupo controle (GC), grupo diabético (GD) e grupo diabético tratado (GT), estudados 1 mês (momento M1) e 12 meses (momento M2) após o início do experimento. O diabetes foi induzido por aloxana endovenosa, na dose de 42 mg/kg. O GT foi tratado com hipoglicemiante oral (acarbose) e insulina subcutânea. Após o sacrifício, os olhos foram preparados para exame ao microscópio eletrônico de transmissão, interessando a ultra-estrutura da membrana de Bruch e os vasos da coróide. RESULTADOS: O exame ultra-estrutural da coróide dos ratos diabéticos mostrou depósitos na membrana de Bruch, acúmulo de vesículas, glicogênio e corpos densos no citoplasma das células endoteliais. O grupo mais afetado foi de ratos diabéticos de 12 meses (GDM2). Os animais com menor intensidade de alterações foram os ratos tratados por 12 meses (GTM2). CONCLUSÃO: Os ratos diabéticos desenvolveram alterações degenerativas na membrana de Bruch e vasos da coróide. Estas alterações foram mais evidentes nos animais submetidos à doença crônica, mas também ocorreram agudamente. O tratamento a curto prazo não foi capaz de evitar os processos degenerativos. A longo prazo, o tratamento inibiu a progressão destes processos.

Descritores: Coróide; Membrana de bruch; Diabetes mellitus experimental; Ratos Wistar; Aloxana; Insulina; Acarbose

ABSTRACT

PURPOSE: To evaluate the diabetic alterations and the impact of short and long-term medical treatment on them. METHODS: Thirty Wistar rats were divided into 3 groups: control (GC), diabetic (DG), and treated diabetic (TG) and the observations were made 1 month (M1) and 12 months (M2) after diabetes induction. Diabetes was induced by intravenous alloxan (42 mg/kg). The treated group received acarbose orally and insulin by subcutaneous injection. Eyes were prepared for transmission electron microscopy, specifically for ultrastructure of the Bruch membrane and choroidal vessels. RESULTS: Ultrastructural examination of the diabetic rat coroid showed deposits in the Bruch membrane and accumulation of vesicles, glycogen and dense bodies in endothelial cell cytoplasm. The most affected group was that of the diabetics on month 12 (GDM2). The treated diabetics showed the least alterations on month 12 (GTM2). CONCLUSION: Diabetic rats develop degenerative alterations in the Bruch membrane and choroidal vessels. These alterations are more evident in animals submitted to chronic disease, but they are also present in acute disease. Degenerative processes were not avoided with short-term treatment. Long-term treatment inhibited the progress of these processes.

Keywords: Choroid; Bruch membrane; Diabetes mellitus, experimental; Rats, Wistar; Alloxan; Insulin; Acarbose

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INTRODUÇÃO

A coróide possui importante papel na nutrição e na manutenção da integridade retiniana⁽¹⁾.

O termo coroidopatia diabética é usado como referência a alterações da coróide decorrentes do diabetes⁽²⁾. Estas alterações são muito semelhantes as que ocorrem na retinopatia^(2-3) e tem importante papel na gênese da retinopatia⁽⁴⁾ e da maculopatia diabética⁽⁵⁾, podendo ser encontradas mesmo na ausência de retinopatia detectável⁽⁶⁾. Os principais fatores de risco para coroidopatia diabética são a severidade da retinopatia e o grau de controle da glicemia⁽⁷⁾.

Com relação a estudos experimentais, há animais que desenvolvem diabetes espontaneamente, como o rato BB Wistar, o cão Keeshond, a macaca Nigra, algumas raças de hamsters e de camundongos. A doença pode, ainda, ser induzida em animais, de várias maneiras: estresse, infecções, toxinas, pancreatectomia; lesões do sistema nervoso central; uso de hormônios antiinsulínicos; exposição à hidrocortisona ou ACTH; indução por vírus e uso de agentes beta-citotóxicos como o aloxano e a estreptozotocina.

Estudos experimentais da coróide de ratos diabéticos demonstram espessamento da membrana basal^(8-9) e diminuição nos sítios aniônicos desta membrana nos vasos da coriocapilar⁽⁹⁾, proliferação de células endoteliais⁽⁸⁾, aceleração dos seus processos degenerativos senescentes⁽¹⁰⁾ e outras alterações hemodinâmicas e de barreira na microcirculação⁽¹¹⁾. Estas alterações são mais acentuadas quanto maior o nível glicêmico, mas também estão presentes em diabetes leve e de maneira desproporcionalmente mais acentuadas do que o suposto pelos níveis glicêmicos⁽¹¹⁾. Podem ser irreversíveis⁽¹²⁾ ou até mesmo aumentar as áreas de destruição quando o nível glicêmico normal é reinstalado⁽¹³⁾.

Hoje, o impacto do controle glicêmico sobre as alterações na retina está bem estabelecido⁽¹⁴⁾.

No entanto, estudos sobre os efeitos deste controle sobre a coróide são poucos e voltados para a resposta aos tratamentos cirúrgicos⁽¹³⁾.

O presente estudo tem o objetivo de comparar a curto e a longo prazo, os efeitos da doença e a repercussão do tratamento medicamentoso sobre a ultra-estrutura da coróide.

 

MÉTODOS

Foram utilizados 30 ratos da raça Wistar, de ambos os sexos, com idade de 3 meses, pesando de 200 a 300 gramas. Os animais foram divididos por sorteio, em 3 grupos experimentais: 10 ratos normais (GC), 10 ratos diabéticos que não receberam tratamento (GD) e 10 ratos diabéticos que receberam tratamento com hipoglicemiante oral, associado a insulinoterapia (GT).

Para indução do diabetes, os ratos receberam injeção endovenosa de solução aquosa de aloxana 2% (2,4,5,6 tetraoxohexahydropyrimidine), em dose única de 42 mg/kg de peso corporal.

Após a indução da doença, os animais foram seguidos por 15 dias para a constatação do estado de diabetes grave. Depois disso, iniciou-se a pesquisa.

Os animais foram sacrificados em dois momentos experimentais: 1 mês após o início do experimento (M₁) e 12 meses após (M₂), sendo sacrificados 5 animais de cada grupo, em cada momento experimental.

A análise ultra-estrutural da coróide foi realizada por microscopia eletrônica de transmissão, nos 30 animais, com atenção à membrana de Bruch e aos vasos.

Os ratos dos grupos GC e do GD receberam ração Nuvilab CR1 (Nuvital Nutrientes e Produtos Veterinários Ltda. - PR). Os do GT receberam hipoglicemiante oral (acarbose - Bay G-5421 - Cia. Bayer do Brasil) adicionado à dieta habitualmente fornecida aos animais, e injeções de insulina porcina monocomponente, de ação prolongada Monotard R (40.000 U/ml - Laboratório Nova Indústria Ltda.).

Quinzenalmente foram realizadas avaliações clínico-laboratoriais, quando os animais foram colocados em gaiolas metabólicas individuais, durante 24 horas.

No momento do sacrifício, os animais receberam dose letal de pentobarbital sódico a 3% (30 mg/kg de peso corporal) endovenoso. Após anestesia, foi feita toracotomia, seguida de punção cardíaca para obtenção de amostras de sangue destinadas aos exames laboratoriais.

Os olhos foram enucleados imediatamente após o sacrifício, sendo preparados para exame ao microscópio eletrônico de transmissão.

 

RESULTADOS

GCM1

A coróide de ratos é constituída por membrana de Bruch, coriocapilar formada por vasos finos e fenestrados, localizados logo abaixo desta membrana e vasos mais calibrosos com característica de vênulas ou arteríolas, mergulhados no estroma e localizados abaixo da coriocapilar (Figura 1A e B).

GCM2

Comparando-se a ultra-estrutura da membrana de Bruch de ratos de GCM₁ com os de GCM₂, não se observaram alterações.

Observaram-se vasos da coriocapilar e estromais com a mesma constituição da observada nos ratos do GCM₁, exceto pela aparente maior quantidade de glicogênio, vesículas citoplasmáticas e corpos densos nas células endoteliais, tanto na região próxima ao lúmen vascular, quanto na porção próxima ao estroma (Figura 1C e D).

GDM1

A ultra-estrutura da membrana de Bruch de ratos GDM₁ foi semelhante à observada em GCM₁. Em algumas regiões observou-se a presença de substância amorfa, homogênea, eletrondensa, que, em algumas áreas, ocupou toda sua espessura (Figura 2A).

Observaram-se vasos com a mesma constituição dos observados em ratos do GCM₁. Com relação à quantidade de vesículas citoplasmáticas, assim como de glicogênio livre, houve aumento da quantidade, quando comparados com animais normais de GCM1 ou de GCM2, tanto em células endoteliais, como nos pericitos. Notou-se, também, aumento da quantidade de corpos densos no citoplasma das células endoteliais e pericíticas (Figura 2B, C e D).

As membranas basais (MB) das células endoteliais e também dos pericitos apresentaram espessura aumentada, principalmente nos vasos de maior calibre (Figura 2B, C e D).

GDM2

A membrana de Bruch de ratos diabéticos de GDM₂ apresentou, em várias regiões, a presença de espaços eletrontransparentes (Figura 2E). Em outras regiões, foi encontrada substância amorfa, eletrondensa entre as camadas de fibras colágenas e elásticas e espessamento da quinta camada (Figura 2F).

Observaram-se vasos com estrutura semelhante aos encontrados nos ratos do GCM₁. Porém, nestes animais, foi possível observar, maior quantidade de vesículas citoplasmáticas, glicogênio livre e de corpos densos do que o encontrado nos animais dos demais grupos, tanto nas células endoteliais, como nos pericitos (Figura 2G).

A MB também esteve mais espessa nos animais deste grupo, principalmente a MB dos vasos de maior calibre. Observaram-se espaços entre as células endoteliais e pericitos totalmente preenchidos pela MB espessada (Figura 2G).

GTM1

Observaram-se na membrana de Bruch de ratos GTM₁, algumas áreas contendo substância amorfa, homogênea, eletrondensa, entre a segunda, terceira e quarta camadas, semelhantes às observadas nos ratos do GDM₁. A densidade deste material, no entanto, foi maior que o daquele observado no GDM₁ (Figura 3A, B e C).

Os vasos da coróide de animais diabéticos tratados mostraram-se semelhantes aos de ratos diabéticos não tratados de mesma idade (GDM1). No entanto, maior número de vesículas citoplasmáticas, glicogênio e corpos densos foram observados, quando comparados ao GDM1, tanto em células endoteliais como em pericitos. Além disso, em algumas células endoteliais, existiram vacúolos contendo material heterogêneo e espaços eletrontrasparentes (Figura 3B, C e D).

GTM2

A membrana de Bruch de ratos GTM₂ foi semelhante à observada no GTM₁ (Figura 3E e F).

As alterações presentes nos vasos dos ratos tratados de GTM₂ foram menos intensas que as existentes nos animais do GDM_2, podendo-se considerá-las semelhantes às encontradas nos ratos do GDM₁ (Figura 3E, G e H).

 

DISCUSSÃO

Membrana de Bruch

O presente estudo mostra depósitos de substância amorfa, homogênea e eletrondensa, em algumas regiões da membrana de Bruch.

A própria senescência pode causar espessamento desta membrana, sugerindo-se que este espessamento possa ser decorrente do depósito progressivo de material provindo da coriocapilar, epitélio pigmentar retiniano ou alterações in situ.

Em humanos diabéticos, são descritas degenerações da membrana de Bruch⁽¹⁵⁾, assim como presença de depósitos⁽¹⁶⁾ e espessamento da quinta camada⁽⁸⁾. As drusas também estão presentes na membrana de diabéticos, o que se observou por meio da angiografia fluorescente⁽¹⁷⁾.

Estudos em ratos demonstram diminuição dos sítios aniônicos da primeira camada⁽⁹⁾, espessamentos focais e difusos, com desarranjo de orientação das fibras colágenas, ou uniformes às custas da condensação do colágeno⁽¹⁸⁾.

Os depósitos foram discretos nos ratos do GDM1, mas importantes no GDM2, onde também foram observados espaços eletrontransparentes por entre as camadas e espessamento da quinta camada. Estas alterações podem ser atribuídas ao diabetes, já que não foram encontradas no grupo controle.

Em relação ao tratamento a curto prazo, não houve diminuição destes depósitos, parecendo ter ocorrido até efeito maléfico, pois os depósitos observados em algumas regiões do GTM1 eram de densidade nitidamente maior, que os observados no GDM1.

A longo prazo, entretanto, o tratamento mostrou seu benefício. As alterações encontradas no GTM2 podem ser comparadas às de GDM1. Assim a continuidade do tratamento parece ter revertido a piora inicial e impedido sua progressão.

Estes achados têm precedentes na literatura. Autores descreveram extensas áreas de destruição na retina e coróide de ratos diabéticos induzidos, submetidos a transplante de ilhotas pancreáticas⁽¹³⁾. Os autores atribuíram estas alterações a processos isquêmicos na microcirculação, questionando-se o retorno a níveis glicêmicos normais como inicialmente maléfico a estas estruturas.

Entretanto, existe apenas aquela referência abordando as alterações na membrana de Bruch após tratamento⁽¹³⁾, o que torna necessário novos estudos para elucidar estes achados e responder a esta pergunta.

Alterações vasculares

Em relação aos vasos da coróide diabética, os estudos existentes mostram de forma variável, alterações muito semelhantes àquelas encontradas na retinopatia diabética⁽²⁾. No entanto, os vasos da coróide não possuem a mesma estrutura que os vasos retinianos, uma vez que são vasos fenestrados e os retinianos, contínuos.

Ratos diabéticos não desenvolvem as mesmas lesões vasculares que os homens. Estes roedores parecem ter resistência maior ao desenvolvimento da vasculopatia. A neovascularização, nunca foi demonstrada na retina destes animais⁽¹⁹⁾, apesar do aumento nos níveis de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), demonstrado nas fibras do nervo óptico, epitélio pigmentar retiniano e coróide de ratos Goto-Kakizaki⁽²⁰⁾.

No entanto, estes animais podem apresentar várias alterações vasculares na retina e na coróide, como espessamento da MB, perda de pericitos, vasodilatação, atrofia capilar, microaneurismas^(21-22) e são usados como modelos experimentais devido, principalmente, ao curto ciclo de vida destes animais.

As alterações vasculares encontradas no presente estudo ocorreram basicamente nas organelas citoplasmáticas das células endoteliais e pericitos e na MB destas células.

No citoplasma, observaram-se acúmulo de vesículas, corpos densos e glicogênio livre.

O significado do aumento das vesículas é desconhecido. Sabe-se que as vesículas citoplasmáticas são relacionadas ao transporte de substâncias, sendo responsáveis, pela remoção de detritos celulares e moléculas tóxicas do interstício para o lúmen vascular, o aumento das mesmas poderia estar relacionado à exacerbação destes processos no diabetes.

Outros acúmulos citoplasmáticos, como o de corpos densos, também relacionados à remoção de detritos intracelulares poderiam novamente, refletir a degeneração das organelas.

O acúmulo de vesículas, corpos densos e glicogênio livre, foi observado nos ratos do GCM2. Assim, existe consistência para supor que possam estar ocorrendo processos degenerativos relacionados com a própria senescência⁽¹⁹⁾. No entanto, a presença destas organelas, em maior quantidade nos animais diabéticos (GDM1 e ainda maior no GDM2), pode ser indício de que o estado diabético esteja relacionado com a exacerbação dos processos degenerativos. Em relação aos grupos tratados, assim como ocorreu na membrana de Bruch, o tratamento a curto prazo não foi capaz de impedir com que ocorressem alterações e o acúmulo das organelas associadas ao mecanismo de "limpeza celular" foi ainda maior no GTM1, que no GDM1, concordando mais uma vez com a literatura⁽¹¹⁾.

A longo prazo, no entanto, o tratamento mostrou seu beneficio através dos achados no GTM2, quando a quantidade de vesículas, corpos densos e glicogênio, foi semelhante ao que se encontrou no GDM1. Assim, os achados ultra-estruturais permitem supor que a continuidade do tratamento do diabetes não só freou os processos degenerativos, mas também foi capaz de reverter alterações inicialmente causadas.

Os acúmulos de vesículas e corpos densos no citoplasma das células endoteliais, encontrados neste estudo, concordam com os achados da literatura no que diz respeito ao processo de degeneração acelerada desses vasos^(10,23).

O espessamento da MB dos vasos, principalmente nos de maior calibre, foi demonstrado nos ratos diabéticos. Este espessamento foi maior no GDM2, que nos demais grupos diabéticos (GDM1, GTM1 e GTM2), nos quais houve semelhança.

O espessamento da parede dos vasos da coróide, às custas de aterosclerose e depósitos PAS (ácido periódico de Schiff) positivos, foram evidentes em estudos histológicos⁽³⁾ e de microscopia eletrônica de varredura⁽⁴⁾ e indiretamente demonstrados pela detecção de retardo de perfusão à angiofluoresceinografia⁽¹⁷⁾. Além do espessamento da MB da coriocapilar, foi demonstrado diminuição dos sítios aniônicos nesta membrana⁽⁹⁾. Posteriormente, demonstrou-se também, que estes sítios estavam diminuídos nas próprias células endoteliais da coriocapilar⁽²³⁾. Eles são importantes para regulação da passagem de proteínas através da membrana de Bruch. Essa barreira aniônica é formada pelas proteoglicanas que, sabidamente, encontram-se reduzidas em tecidos diabéticos como, por exemplo, na lâmina basal do glomérulo renal⁽²³⁾.

Utilizando ratos diabéticos e hipertensos, autores encontraram proliferação aumentada de células endoteliais que levaram a estreitamento na luz vascular; no entanto, este achado foi mais evidente nos ratos que também eram hipertensos, animais que apresentavam, portanto, superposição de fatores agressores⁽⁸⁾. A hipercelularidade vascular também é achada de literatura⁽⁴⁾ que não foi observada no presente estudo.

Outros estudos feitos em vasos coroidais diabéticos não mostraram alteração no tamanho do capilar ou na distribuição do número de pericitos⁽²¹⁾. Estes autores realizaram, inclusive, medidas morfométricas da área luminal, espaços intervasculares, número de fenestrações voltadas para o epitélio pigmentar retiniano e para o estroma, não encontrando diferença estatisticamente significativa entre ratos normais e diabéticos. Assim, apesar de terem observado alterações ultra-estruturais, as medidas morfométricas não diferiram entre ratos normais e diabéticos.

Talvez estas aparentes discrepâncias entre os estudos possam ser explicadas pela sugestão de que, não só o processo de degeneração, mas também o de renovação destes vasos, estejam aumentados⁽²³⁾. Ou seja, as alterações vasculares são dinâmicas, havendo chance de lesão e de reparação, o que pode permitir diferentes observações.

 

CONCLUSÃO

Diante dos resultados obtidos no presente estudo, foi possível concluir que os ratos normais M2 apresentaram discretas alterações em componentes citoplasmáticos das células endoteliais, provavelmente por processo de senilidade.

Os ratos diabéticos apresentaram alterações ultra-estruturais na coróide, ocorrendo na membrana de Bruch e nos vasos. Estas alterações foram mais evidentes nos animais submetidos à doença crônica, mas também ocorreram agudamente.

O tratamento do diabetes a curto prazo não impediu os processos degenerativos e aparentemente até os exacerbou, tanto na membrana de Bruch, como nos vasos da coróide. A longo prazo, o tratamento mostrou-se efetivo, inibindo a progressão dos processos degenerativos.

 

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Endereço para correspondência:
Antonio Carlos Lottelli Rodrigues
Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP
Distrito de Rubião Júnior s/nº
Botucatu (SP) CEP 18618-970
E-mail: [email protected]

Recebido para publicação em 05.08.2006
Aprovação em 26.02.2007

 

 

Trabalho realizado no Laboratório Experimental da Faculdade de Medicina da Universidade Estadual Paulista "Júlio Mesquita Filho" - UNESP - Botucatu (SP) - Brasil.